什么是MRD

MRD，即分子殘留病灶（亦稱微小殘留病灶或可測(cè)量殘留病灶），其概念源于血液腫瘤，是指經(jīng)過(guò)治療后，影像學(xué)或傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室方法不能發(fā)現(xiàn)，但通過(guò)液體活檢發(fā)現(xiàn)的腫瘤來(lái)源分子異常（外周血可穩(wěn)定檢出豐度≥0.02%的ctDNA，包括驅(qū)動(dòng)基因或其他的I/II類基因變異），代表著腫瘤的持續(xù)存在和臨床進(jìn)展可能^[1]。廣義上說(shuō)，MRD的檢測(cè)內(nèi)容可包含體液（常見(jiàn)為血液）中來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，包括但不限于ctDNA、ctRNA、CTC、外泌體及其他物質(zhì)，檢測(cè)范圍包括了基因組學(xué)和蛋白組學(xué)^[2][3]。基于NGS的ctDNA突變檢測(cè)是目前實(shí)體瘤MRD檢測(cè)最常用的方法。在結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌中，有充分證據(jù)表明MRD具有預(yù)后分層作用，臨床價(jià)值較明確;在胰腺癌、肝癌、食管癌、胃癌等其它實(shí)體瘤中，也有一些證據(jù)提示MRD具有預(yù)后分層作用^[4]。

那么，MRD到底什么時(shí)候做？怎么做？本文將分兩期通過(guò)MRD的分析策略、Landmark檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)、臨床意義、檢測(cè)難點(diǎn)等方面進(jìn)行闡述。

MRD的分析策略

實(shí)體瘤MRD檢測(cè)根據(jù)是否參考腫瘤組織突變信息分為腫瘤組織先驗(yàn)分析（tumor-informed）和腫瘤組織未知分析（tumor-agnostic/naive）兩種分析策略。

腫瘤組織先驗(yàn)分析（Tumor-informed assays）需要對(duì)腫瘤組織進(jìn)行WES（或大panel）+個(gè)性化panel的檢測(cè)。腫瘤組織先驗(yàn)（Tumor-informed）策略首先需要對(duì)患者的腫瘤組織進(jìn)行高通量測(cè)序（以WES為主），確定每位患者的腫瘤特異突變，并且選擇一定數(shù)量的高豐度的軀干突變定制個(gè)性化panel（通常只包括16~50個(gè)腫瘤特異突變），最后在患者血漿ctDNA中檢測(cè)這些突變，相當(dāng)于WES（或大panel）+個(gè)性化panel的檢測(cè)。該分析策略因檢測(cè)突變靶點(diǎn)少，大幅降低了由于技術(shù)和生物背景（比如克隆性造血）導(dǎo)致的假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)，也因此可以進(jìn)行極高深度的測(cè)序，提高檢測(cè)的靈敏度。目前市場(chǎng)上MRD產(chǎn)品多基于此策略。

Tumor-informed還有一種固定panel檢測(cè)策略：在基線組織檢測(cè)后，后續(xù)監(jiān)測(cè)使用固定Panel。Panel通?；诔Ｒ?jiàn)驅(qū)動(dòng)基因和靶向藥物作用位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，這限制了其適用性，市場(chǎng)上較少見(jiàn)到。

腫瘤組織未知分析（tumor-agnostic/naive）不需要獲取腫瘤組織，直接進(jìn)行固定化panel檢測(cè)。該策略主要是用一個(gè)普適性、一般有三四百個(gè)基因甚至更多基因的大panel進(jìn)行檢測(cè)，相當(dāng)于固定化panel的檢測(cè)。采用固定的突變panel，無(wú)須預(yù)先獲取患者腫瘤組織進(jìn)行測(cè)序，可以大幅簡(jiǎn)化流程、降低成本及縮短患者M(jìn)RD狀態(tài)評(píng)估周期。在制定患者輔助治療的決策過(guò)程中，輔助治療的延遲可能會(huì)降低治療療效，因此快速評(píng)估患者M(jìn)RD狀態(tài)，從而盡早進(jìn)行臨床決策也十分重要^[5]。

這兩種策略孰優(yōu)孰劣呢？

三種策略對(duì)比^[6][7]

MEDAL研究是全球首個(gè)早期肺癌頭對(duì)頭對(duì)比三種MRD檢測(cè)策略的前瞻性臨床研究，該研究中，所有選擇的變異中有98.2%是非標(biāo)準(zhǔn)的，其中99.9%是唯一存在于一個(gè)患者中的。如果只監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的突變，近一半landmark（治療后的單個(gè)時(shí)間點(diǎn)）的MRD陽(yáng)性樣本將無(wú)法識(shí)別。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)PROPHET（Tumor-informed定制化Panel）在基線時(shí)對(duì)DFS和OS的預(yù)測(cè)能力高于Tumor-agnostic和Tumor-informed固定化Panel檢測(cè)。在實(shí)體瘤分子殘留病灶（MRD）檢測(cè)共識(shí)中也明確提到基于腫瘤組織突變的tumor-informed分析相對(duì)于tumor-agnostic/naive分析具有更好的敏感性和特異性，優(yōu)先考慮采用tumor-informed分析策略。

Landmark檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)

01.新輔助治療

CTONG1804是一項(xiàng)前瞻性多中心II期研究基于PD-L1表達(dá)評(píng)估了新輔助nivolumab單藥（N）和nivolumab-化療（N/C）組合的臨床療效。

對(duì)38名患者在治療前收集的血漿樣本進(jìn)行分析，在89.5%(34/38)的治療前樣品中檢測(cè)到ctDNA，包括21.1%(8/38)的II期疾病和68.4%(26/38)的III期疾病。ctDNA檢出率在新輔助治療期間下降，從治療前(T0)的89.5%下降到新輔助治療后(T2)的34.2%，然后在手術(shù)后(T3)繼續(xù)下降到27.6%。具體來(lái)說(shuō)，新輔助免疫單藥N和N/C分別使ctDNA陽(yáng)性率降低42.9%(T3)和18.2%(T3)。

在所有局部和遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的患者中，至少在一個(gè)點(diǎn)上觀察到可檢測(cè)的ctDNA。ctDNA/MRD–(T2和T3)患者與ctDNA/MRD+(T2或T3)患者的18個(gè)月EFS率分別為93.8%和47.3%。結(jié)果提示：新輔助治療和手術(shù)后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的ctDNA陰性，可預(yù)測(cè)pCR和生存益處，需在前瞻性臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

ctDNA/MRD –(T2和T3)患者與ctDNA/MRD+(T2或T3)患者的EFS^[8]

MRD對(duì)新輔助治療療效的評(píng)估價(jià)值在膀胱癌^[9]、結(jié)直腸癌^[10]、乳腺癌^[11]等也均已有文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)有證據(jù)提示新輔助治療后ctDNA清除對(duì)于預(yù)測(cè)遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)是潛在的有效標(biāo)志物：若患者接受新輔助治療后ctDNA陽(yáng)性，則可能預(yù)后較差，不適合進(jìn)行器官功能保留，需考慮及時(shí)調(diào)整治療方案?；赾tDNA的MRD狀態(tài)評(píng)估可潛在輔助臨床篩選適合采用非手術(shù)治療方案的優(yōu)勢(shì)人群，為進(jìn)展期患者的精細(xì)化全程管理提供新思路。胃癌患者若接受輔助治療則建議在治療前接受MRD檢測(cè)，有助于判斷預(yù)后和制訂進(jìn)一步的治療隨訪策略；接受新輔助治療的局部進(jìn)展期胃癌患者在治療過(guò)程中可考慮行MRD動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)^[12]。

然而，術(shù)前ctDNA-MRD結(jié)果并不總是與其在術(shù)后的結(jié)果保持相關(guān)性，有研究發(fā)現(xiàn)，在47位復(fù)發(fā)非小細(xì)胞肺癌患者中，14例患者在術(shù)前MRD檢測(cè)結(jié)果為陰性，但在術(shù)后監(jiān)測(cè)中卻為MRD陽(yáng)性^[13]。這表明術(shù)前ctDNA-MRD結(jié)果并不影響其在術(shù)后監(jiān)測(cè)中的結(jié)論，且更加明確了術(shù)后MRD監(jiān)測(cè)的重要性。

研究發(fā)現(xiàn)，患者術(shù)前ctDNA-MRD狀態(tài)與多個(gè)因素存在關(guān)聯(lián)，包括腫瘤大小、腫瘤分期、病理類型、基因型等。具體來(lái)說(shuō)，腫瘤體積越大、分期越晚，其術(shù)前ctDNA-MRD陽(yáng)性率越高^[14][15]。關(guān)于術(shù)前ctDNA-MRD檢測(cè)的結(jié)果在預(yù)后方面的作用尚未達(dá)成一致的結(jié)論。術(shù)前ctDNA-MRD在不同癌種或不同病理類型中存在異質(zhì)性，還需要更多研究明確其在不同癌種中的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。

02.根治性治療之后，輔助治療之前

目前，MRD大多數(shù)首次檢測(cè)都在此時(shí)。

NCT02965391研究在手術(shù)前即刻(時(shí)間A)和腫瘤切除后多個(gè)預(yù)先指定的時(shí)間點(diǎn)[時(shí)間B(5分鐘)、時(shí)間C(30分鐘)和時(shí)間D(2小時(shí))]和手術(shù)后[時(shí)間P1(1天)、時(shí)間P2(3天)和時(shí)間P3(1個(gè)月)]獲得10毫升血漿樣品。腫瘤根治術(shù)后ctDNA迅速衰減。在術(shù)后1天時(shí)MRD陽(yáng)性和陰性患者的平均RFS和平均OS都無(wú)顯著差異；而在術(shù)后3天和術(shù)后1個(gè)月時(shí)MRD陽(yáng)性和陰性患者的RFS和OS存在顯著差異。提示術(shù)后3天和術(shù)后1個(gè)月的MRD檢測(cè)結(jié)果與患者的腫瘤復(fù)發(fā)和生存更為相關(guān)。

術(shù)后1天時(shí)MRD陽(yáng)性和陰性患者的平均RFS和平均OS^[16]

術(shù)后3天時(shí)MRD陽(yáng)性和陰性患者的平均RFS和平均OS^[16]

目前對(duì)于MRD基線分析采樣時(shí)機(jī)、檢測(cè)時(shí)機(jī)均未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，非小細(xì)胞肺癌分子殘留病灶專家共識(shí)推薦MRD首次檢測(cè)的時(shí)間窗在NSCLC根治性治療后1周到1個(gè)月之內(nèi)。胃癌分子殘留病灶檢測(cè)與臨床應(yīng)用中國(guó)專家共識(shí)（2023版）推薦進(jìn)展期胃癌在根治性手術(shù)后或術(shù)后首次隨訪時(shí)，可考慮行MRD檢測(cè)。美國(guó)專家建議手術(shù)后兩周采集初始血液樣本進(jìn)行基于ctDNA的MRD檢測(cè)，當(dāng)為陰性結(jié)果后，可以縮短監(jiān)測(cè)時(shí)間(如1個(gè)月后)進(jìn)行陰性結(jié)果的再確認(rèn)，但應(yīng)在輔助治療開(kāi)始前完成^[17]。

綜上并結(jié)合共識(shí)，筆者推薦實(shí)體瘤患者M(jìn)RD首次檢測(cè)點(diǎn)應(yīng)在根治性手術(shù)之后1周至一個(gè)月內(nèi)，輔助治療開(kāi)始之前；根治性放化療之后，鞏固治療之前或放療進(jìn)度一半時(shí)^[18]；系統(tǒng)治療后完全緩解的晚期患者為宜。術(shù)前檢測(cè)可評(píng)估新輔助治療效果，對(duì)預(yù)后的評(píng)估重點(diǎn)要看術(shù)后MRD狀態(tài)。

03.Longitudinal檢測(cè)延續(xù)時(shí)間

Longitudinal指在根治性治療后的一系列時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行連續(xù)性監(jiān)測(cè)，如術(shù)后3個(gè)月、6個(gè)月等，以全面評(píng)估患者的疾病進(jìn)展可能和MRD狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化。在此期間患者的MRD結(jié)果均為陰性者，則定義為L(zhǎng)ongitudinal陰性；如果在任意監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)上，患者的MRD檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則定義為L(zhǎng)ongitudinal陽(yáng)性。多個(gè)研究的匯總分析表明，術(shù)后Landmark單點(diǎn)MRD陽(yáng)性始終與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，特異性大于90%，但是敏感性相對(duì)較低，中位敏感性為56%。說(shuō)明Longitudinal的結(jié)果對(duì)患者分層具有更好的敏感性和特異性，文獻(xiàn)報(bào)道其敏感性達(dá)到了100%，中位敏感性為89%^[19]。上述結(jié)論表明：長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)監(jiān)控對(duì)于復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估更準(zhǔn)確。

在CIRCULATE-Japan研究中，研究者根據(jù)結(jié)直腸癌患者術(shù)后4周和12周的MRD檢測(cè)結(jié)果，將患者分為持續(xù)陽(yáng)性、陽(yáng)性轉(zhuǎn)陰性、陰性轉(zhuǎn)陽(yáng)性、持續(xù)陰性性四組，結(jié)果表明“陽(yáng)性轉(zhuǎn)陰性”組的DFS較“陽(yáng)性轉(zhuǎn)陽(yáng)性”組有顯著提升（81.4%vs33.8%）。再次強(qiáng)調(diào)了長(zhǎng)期監(jiān)控的重要性。

 四組的DFS比較^[20]

那么，Longitudinal要持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間？吳一龍教授團(tuán)隊(duì)在晚期肺癌患者適應(yīng)性降階治療研究中，患者的中位隨訪19.2個(gè)月，整體人群的中位無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）為18.4個(gè)月^[21]。非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)研究表明，術(shù)后12至18個(gè)月是MRD高峰檢測(cè)時(shí)間范圍。若患者維持MRD陰性超過(guò)18個(gè)月，復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)逐步降低。

綜上，筆者建議患者每3~6個(gè)月進(jìn)行一次MRD檢測(cè)，持續(xù)至少2年。具體檢測(cè)時(shí)間可與患者返院隨訪時(shí)間結(jié)合。

亦有觀點(diǎn)認(rèn)為對(duì)于1B期及以后的建議每3個(gè)月復(fù)查一次，到術(shù)后三年；對(duì)于1B期之前的患者術(shù)后建議3-6個(gè)月復(fù)查一次，同步隨訪MRD檢測(cè)。但未見(jiàn)其出處，僅供參考。

飛朔生物檢測(cè)策略

飛朔生物自主研發(fā)的實(shí)體瘤分子殘留病灶(MRD)檢測(cè)產(chǎn)品采用定制化Panel檢測(cè)策略，先對(duì)原發(fā)腫瘤組織進(jìn)行全面的全外顯子測(cè)序，確定患者特異的基因突變結(jié)果，然后定制個(gè)性化Panel對(duì)組織中的一定數(shù)量的突變位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)的ctDNA檢測(cè)。對(duì)比同類產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)明顯。

自主研發(fā)腫瘤版WES（全外顯子測(cè)序）檢測(cè)，在WES的基礎(chǔ)上增加腫瘤熱點(diǎn)突變區(qū)域、常見(jiàn)基因融合相關(guān)的內(nèi)含子區(qū)域、非編碼區(qū)ClinVar致病性位點(diǎn)、SNP骨架和MSI區(qū)域的探針覆蓋；基線樣本檢測(cè)結(jié)果覆蓋導(dǎo)靶向治療，免疫治療和遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估；

個(gè)體化定制panel采用自研的單側(cè)引物擴(kuò)增結(jié)合UMI的測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)；

自動(dòng)化監(jiān)測(cè)位點(diǎn)篩選，通過(guò)突變位點(diǎn)的頻率，基因的功能，突變類型和突變等級(jí)等指標(biāo)加權(quán)評(píng)分，從位點(diǎn)的篩選提高監(jiān)測(cè)的靈敏度；

采用超高深度測(cè)序（100000X）結(jié)合UMI分析可以實(shí)現(xiàn)0.05%的突變檢測(cè)靈敏，滿足MRD的檢測(cè)性能要求；

基線分析+多次動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，腫瘤診療全周期MRD動(dòng)態(tài)監(jiān)控；

靈活性全周期管理，多向選擇；

適用于多種實(shí)體瘤的預(yù)后預(yù)測(cè)、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、療效監(jiān)測(cè)。

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